Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via email.Torna a Diari » Rivista Internazionale di Nanomedicina » Volume 12Autori Wang N, Wang Z, Nie S, Song L, He T, Yang S, Yang X, Yi C, Wu Q, Gong CPubblicato il 23 febbraio 2017 Volume 2017:12 Pagine 1499—1514DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S124843Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Professor Lei YangNing Wang, Zhihan Wang,* Shihong Nie,* Linjiang Song, Tao He, Suleixin Yang, Xi Yang, Cheng Yi, Qinjie Wu, Changyang Gong State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, Collaborative Innovation Center for Biotherapy, West China Hospital, Università di Sichuan, Chengdu, Repubblica popolare cinese *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Abstract: La combinazione di farmaci chemioterapici attira maggiore attenzione negli studi clinici sul cancro.Tuttavia, la scarsa solubilità in acqua dei farmaci chemioterapici ne limita l'applicazione antitumorale.Al fine di migliorare l'efficienza antitumorale e ridurre gli effetti collaterali dei farmaci liberi, abbiamo preparato micelle combinate di paclitaxel (PTX) e honokiol (HK) metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone) (P–H/M) mediante metodo di dispersione solida contro cancro al seno.La dimensione delle particelle di P–H/M era 28,7±2,5 nm e l'immagine del microscopio elettronico a trasmissione confermava che P–H/M erano di forma sferica con piccole dimensioni delle particelle.Dopo essere stato incapsulato nelle micelle, il rilascio di PTX o HK ha mostrato un comportamento sostenuto in vitro.Inoltre, sia la citotossicità che l'assorbimento cellulare di P–H/M erano aumentate nelle cellule 4T1 e P–H/M hanno indotto più apoptosi rispetto alle micelle caricate con PTX o alle micelle caricate con HK, come analizzato dal test di citometria a flusso e Western macchia.Inoltre, l'effetto antitumorale di P–H/M è stato significativamente migliorato rispetto alle micelle caricate con PTX o alle micelle caricate con HK in vivo.P-H/M erano più efficaci nell'inibire la proliferazione del tumore, nell'indurre l'apoptosi del tumore e nel diminuire la densità della microvascolarizzazione.Inoltre, l'analisi di bioimaging ha mostrato che le micelle polimeriche caricate con il farmaco potrebbero accumularsi di più nei tessuti tumorali rispetto al farmaco libero.I nostri risultati hanno suggerito che P-H/M potrebbe avere potenziali applicazioni nella terapia del cancro al seno.Parole chiave: paclitaxel, honokiol, micelle, codelivery, cancro al senoEssendo uno dei tumori maligni più comuni, il cancro al seno ha mostrato un'incidenza crescente negli ultimi anni ed è il tumore più comune tra le donne con una stima di 231.840 nuovi casi di cancro diagnosticati negli Stati Uniti fino al 2015.1 Attualmente, la chemioterapia rimane uno dei principali trattamenti per pazienti con cancro al seno in diversi stadi.Tuttavia, un'ampia percentuale di pazienti soffre di gravi effetti collaterali indesiderati, bassa biodisponibilità o resistenza ai farmaci, con conseguente fallimento terapeutico nella pratica clinica.2 Pertanto, la scoperta di strategie terapeutiche più efficienti e meno tossiche per il cancro al seno sta ottenendo l'attenzione popolare.Il paclitaxel (PTX), un agente stabilizzante dei microtubuli, è uno dei farmaci antitumorali più efficaci in molti tumori, tra cui il cancro ovarico, il cancro al seno, il cancro del polmone non a piccole cellule e i carcinomi della testa e del collo.3-5 Tuttavia, il la scarsa solubilità acquosa del PTX ne ha limitato l'applicazione clinica.Cremophor EL e alcol disidratato (1:1, v/v) sono stati utilizzati nell'attuale formulazione clinica di PTX per migliorarne la solubilità prima di diluire da 5 a 20 volte in soluzione salina normale (NS) o destrosio.Sfortunatamente, Cremophor EL rilascia istamina dopo la degradazione nel corpo, causando gravi effetti collaterali, come l'ipersensibilità.6 È imperativo sviluppare nuove strategie per migliorare la solubilità acquosa del PTX, potenziare l'effetto antitumorale ed evitare effetti avversi, compresi quelli che combinano prodotti naturali o composti con PTX o altri reagenti chemioterapici standard.L'honokiol (HK) è un componente attivo isolato e purificato dalle radici, dalla corteccia dello stelo o dal cono di semi della magnolia tradizionale cinese.HK è noto da tempo per avere effetti antitrombotici, antibatterici e ansiolitici.7–9 Negli ultimi anni, è stato dimostrato che HK inibisce la crescita e induce l'apoptosi di diverse linee cellulari tumorali ed è stato utilizzato come potenziale agente antitumorale.10–12 Inoltre, HK mostra potenti attività antitumorali e migliora ulteriormente le chemioterapie convenzionali in una varietà di modelli preclinici di cancro umano, tra cui leucemia linfocitica cronica, cancro alla prostata e mieloma multiplo.13 HK utilizzato in questo studio è stato estratto nel nostro laboratorio da un'elevata capacità cromatografia in controcorrente ad alta velocità (HSCCC ad alta capacità) con purezza del 98,6%.14Negli ultimi decenni, le micelle polimeriche hanno attirato una crescente attenzione e hanno svolto un ruolo importante nei sistemi di somministrazione dei farmaci.15 Le micelle hanno formato una struttura nucleo-guscio con farmaci idrofobici che si combinano nel nucleo idrofobo e nel guscio idrofilo stabilizzando l'aspetto in soluzione acquosa.16 Questa caratteristica mostra un vantaggio cruciale per lo sviluppo di formulazioni acquose per farmaci idrofobici.17 Pertanto, le micelle polimeriche potrebbero incapsulare farmaci idrofobici, inclusa anche la combinazione di diversi farmaci chemioterapici, per formare soluzioni acquose stabili e omogenee per applicazioni endovenose.18-20 Inoltre, polimerico le micelle hanno mostrato una buona biodegradabilità e biocompatibilità, che eviterebbe effetti collaterali sulle cellule normali e prolungherebbe anche l'emivita dei farmaci in vivo.21In questo studio, le micelle combinate PTX e HK metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone) (MPEG–PCL) (P–H/M) sono state preparate utilizzando un copolimero diblocco MPEG–PCL anfifilico non tossico e biodegradabile.Gli esperimenti per rilevare la sua attività antitumorale sono stati condotti in vitro e in vivo.Sono stati studiati in dettaglio la citotossicità, l'assorbimento cellulare, l'apoptosi e l'espressione della famiglia delle caspasi in vitro.Successivamente, sono stati utilizzati modelli di tumore sottocutaneo 4T1 per valutare l'attività antitumorale di P-H/M.La densità della microvascolarizzazione del tumore, la proliferazione del tumore e il dosaggio dell'apoptosi tumorale sono stati studiati in vivo.Inoltre, la capacità target delle micelle polimeriche è stata confrontata in vivo.I nostri risultati hanno indicato che P-H/M ha mostrato una grande attività antitumorale e potrebbe avere potenziali applicazioni nella terapia del cancro al seno.Materiali, linee cellulari e animaliPTX (Shanxi SENFU Biotechnology, Shanxi, Repubblica popolare cinese), metil tiazolil tetrazolio (MTT; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), MPEG (peso molecolare; Mn = 2.000; Fluka, St Louis, MO, USA) , ε-caprolattone (ε-CL; Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA), ottoato stannoso (Sn(Oct)2; Sigma-Aldrich), acetone (KeLong Chemicals, ChengDu, Repubblica popolare cinese), dimetilsolfossido ( DMSO; KeLong Chemicals), annessina V-fluoresceina isotiocianato (FITC) kit di rilevamento dell'apoptosi (KeyGEN Biotech, Nanchino, Repubblica popolare cinese), poliossietilene sorbitano monooleato (Tween 80; KeLong Chemicals) e antigeni per Western blot (Abcam, San Francisco , CA, USA) sono stati utilizzati come ricevuti.HK è stato purificato nel nostro laboratorio.20 Tutti i materiali utilizzati in questo articolo erano di grado reagente analitico (AR) e utilizzati come ricevuti.La linea cellulare di carcinoma mammario murino (4T1) e la linea cellulare di rene embrionale umano 293 (HEK 293) sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA).Le cellule sono state coltivate nel Roswell Park Memorial Institute-1640 (Gibco, Waltham, MA, USA), contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato al calore (FBS; Caoyuan Lvye, Huhht, Repubblica popolare cinese) e 100 U/mL di penicillina e streptomicina.Topi femmina Balb/c e topi nudi femmina Balb/c sono stati acquistati dal Laboratory Animal Center dell'Università di Sichuan (Chengdu, Repubblica popolare cinese).Gli animali sono stati alloggiati a una temperatura controllata di 20°C–22°C e un'umidità relativa del 50%–60% con cicli luce-buio di 12 ore.Tutti gli animali sono stati in quarantena per una settimana prima del trattamento.Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite seguendo il protocollo e le linee guida dell'Animal Welfare Act.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e il trattamento degli animali dell'Università di Sichuan (Chengdu, Repubblica popolare cinese).Sintesi del copolimero MPEG–PCL e preparazione del P–H/MIl copolimero diblocco MPEG-PCL (Mn = 4.000) è stato sintetizzato mediante polimerizzazione ad anello aperto di ε-CL su MPEG-PCL utilizzando Sn(Oct)2 come catalizzatore secondo i nostri precedenti rapporti.22,23 In breve, MPEG e ε -CL sono stati posti simultaneamente in una fiala di vetro secca sotto atmosfera di azoto e una quantità calcolata di Sn(Oct)2 è stata aggiunta sotto blanda agitazione magnetica.Il sistema di reazione è stato mantenuto a 130°C per 6 h.I prodotti finali sono stati sciolti in diclorometano e riprecipitati dal filtrato usando dietiletere.Quindi, il copolimero MPEG-PCL è stato dializzato con cutoff del peso molecolare (MWCO): 3.000 Da) contro acqua a doppia distillazione per 3 giorni, liofilizzato e conservato in un essiccatore di vetro prima di un ulteriore utilizzo.Il peso molecolare del copolimero MPEG-PCL ottenuto era 3.950 Da (2.000–1.950 Da), calcolato mediante risonanza magnetica nucleare 1H (spettrometro 400; Varian Medical Systems, Inc., Palo Alto, CA, USA).P–H/M sono stati preparati con il metodo della dispersione solida.In breve, i copolimeri HK, PTX e MPEG-PCL sono stati disciolti in acetone ed evaporati in un evaporatore rotante a 60°C.Successivamente, la coincapsulazione del farmaco e delle micelle è stata disciolta in acqua o soluzione salina a 60°C per autoassemblare per P–H/M.Le micelle caricate con PTX (PTX/M) e le micelle caricate con HK (HK/M) sono state preparate allo stesso modo.Tutte le micelle sono state filtrate attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm (Millex-LG; Millipore Co., Billerica, MA, USA) e sono state liofilizzate e conservate a 4°C prima dell'uso.La dimensione delle particelle e il potenziale zeta del P–H/M sono stati determinati utilizzando l'analizzatore granulometrico laser Malvern Nano ZS90.I campioni sono stati diluiti con acqua pura per il rilevamento.La temperatura è stata mantenuta a 25°C durante il processo di misurazione.Tutti i risultati erano la media di tre esecuzioni di test e tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (DS).La morfologia di P–H/M è stata osservata al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) (H-6009IV; Hitachi, Tokyo, Giappone).Le micelle sono state diluite con acqua distillata e poste su una griglia di rame ricoperta di nitrocellulosa.I campioni sono stati colorati negativamente con acido fosfotungstico ed essiccati a temperatura ambiente.Lo studio cristallografico è stato eseguito su polvere di micelle vuote o cariche di farmaco utilizzando il diffrattometro a raggi X (XRD) (X'Pert Pro MPD; Philips, Amsterdam, Paesi Bassi).I campioni sono stati scansionati da 2θ di intervallo di misurazione dell'angolo 1°–160°.Le concentrazioni di PTX o HK sono state determinate da uno strumento di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC; LC-20AD; Shimadzu, Kyoto, Giappone).I campioni sono stati diluiti prima della misurazione.Ogni campione è stato analizzato tre volte.L'efficienza di caricamento del farmaco (DL) e l'efficienza di incapsulamento (EE) del P–H/M sono state determinate secondo le seguenti equazioni.In breve, 20 mg di micelle caricate con farmaco liofilizzate sono stati disciolti in 0,2 mL di acetonitrile.Il DL e l'EE di P–H/M sono stati calcolati secondo le seguenti equazioni:Comportamento di rilascio del farmaco in vitroPer determinare la cinetica di rilascio di HK o PTX dalle micelle, abbiamo utilizzato un metodo di dialisi modificato come nel lavoro precedente.24 Il PTX libero o HK libero è stato sciolto in una soluzione di DMSO-acqua e la concentrazione di PTX o HK era 1 mg/mL , che era la stessa dose di HK/M, PTX/M e P–H/M.La soluzione è stata posta in una sacca per dialisi (MWCO è 3,5 kDa), che è stata incubata in una soluzione tamponata con fosfato (pH 7,4) contenente Tween 80 (0,5%, p/p) con agitazione delicata (100 rpm) in un BD da 15 ml tubo (Becton, Dickinson e Comany, Franklin Lakes, NY, USA) a 37°C.A tempi predeterminati, è stato raccolto 1 mL di mezzo di incubazione e il mezzo rimanente è stato sostituito con mezzo fresco.Dopo centrifugazione per 10 minuti, i supernatanti dei mezzi di rilascio rimossi sono stati raccolti e conservati a -20°C.Il comportamento di rilascio di PTX o HK è stato quantificato utilizzando HPLC.Tutti i dati sono espressi come media ± DS.Il metodo MTT è stato utilizzato per studiare la citotossicità di PTX/M, HK/M e P–H/M contro le cellule 4T1.In breve, le cellule 4T1 sono state piastrate in piastre da 96 pozzetti.Dopo 12 ore, le cellule sono state esposte a PTX/M, HK/M o P–H/M a varie concentrazioni (0–40 μg/mL) per 48 ore.Il test di vitalità cellulare è stato eseguito utilizzando il metodo MTT.L'esperimento è stato eseguito in triplicato.L'indice sinergico è stato calcolato utilizzando i metodi delle formule.Inoltre, la valutazione della citotossicità delle micelle bianche (0–2.000 μg/mL) è stata condotta su cellule 293T e cellule 4T1 come controllo.Tutti i dati sono espressi come media ± DS.Assorbimento cellulare di PTX e HKLa quantificazione dell'assorbimento cellulare di PTX e HK, PTX/M, HK/M o P–H/M è stata valutata su cellule 4T1 a intervalli di tempo diversi (2 e 4 ore).La concentrazione del farmaco di PTX o HK era basata sul valore della metà della concentrazione inibitoria massima (IC50) calcolato dal test di citotossicità cellulare.Le cellule sono state coltivate in una piastra a sei pozzetti per 24 ore, quindi il mezzo di crescita è stato sostituito con un terreno privo di siero contenente una certa quantità di PTX/M, HK/M e P–H/M (25, 25, e 25+25 μg/mL).Dopo l'incubazione per 2 e 4 ore, le cellule sono state raccolte e lisate mediante tampone del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Sigma-Aldrich) per 30 minuti su ghiaccio e PTX o HK sono stati estratti dalla miscela di acetato di etile e n-esano (1:3).I campioni sono stati misurati mediante HPLC (LC-20AD).Il test dell'apoptosi è stato eseguito mediante citometria a flusso (FCM) (BD, FACSCalibur™; BD Biosciences, Lake Franklin, NJ, USA) utilizzando la colorazione di annessina V/propidio ioduro (PI) (KeyGEN Biotech) coniugata con FITC secondo le istruzioni del produttore.In breve, le cellule 4T1 sono state incubate in una piastra a sei pozzetti per 12 ore.Quindi, le cellule sono state esposte a un mezzo privo di siero contenente una certa quantità di PTX/M, HK/M o P–H/M (25, 25 e 25+25 μg/mL) per 24 ore.L'entità dell'apoptosi è stata valutata da FCM.Sia le cellule apoptotiche precoci (Annexin V+/PI−) che quelle apoptotiche tardive (Annexin V+/PI+) sono state incluse nelle determinazioni dell'apoptosi cellulare.Per determinare l'effetto inibitorio di P-H/M sulla via del segnale dell'apoptosi, le cellule 4T1 sono state coltivate in piatti per 12 ore.Quindi, le cellule sono state trattate con terreno privo di siero contenente una certa quantità di PTX/M, HK/M e P–H/M (25, 25 e 25+25 μg/mL).Dopo incubazione per 24 ore, le cellule 4T1 sono state lisate dal tampone RIPA per 30 minuti in ghiaccio.Dopo centrifugazione per 15 minuti a 4°C, il supernatante è stato raccolto e fatto bollire con tampone sodio dodecil solfato (SDS) per 5 minuti.Quindi, i campioni sono stati conservati a -20°C per un uso successivo.Questi diversi campioni proteici sono stati rilevati mediante elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide e incubati con anticorpi (Abcam), tra cui caspasi 3, caspasi 3, caspasi 8, caspasi 8 scissa e caspasi 9, caspasi 9 scissa. Western blot sono stati sviluppati con perossidasi di rafano (HRP) anticorpi secondari coniugati e substrato chemiluminescente su pellicole radiografiche Kodak.Topi femmina BALB/c (di età compresa tra 6 e 8 settimane), del peso di 18 ± 2 g, sono stati utilizzati per i test antitumorali in vivo.I topi sono stati iniettati con sospensione cellulare 4T1 (5 × 105 cellule) nel gluteo destro.Quando il volume medio del tumore ha raggiunto 100 mm3, i topi portatori di tumore sono stati divisi casualmente in cinque gruppi (sei topi per gruppo).I topi sono stati iniettati per via endovenosa ogni 3 giorni con 100 μL di PTX/M (la concentrazione di PTX era di 10 mg/kg di peso corporeo), HK/M (la concentrazione di HK era di 10 mg/kg di peso corporeo) o P–H /M (la concentrazione di HK o PTX era di 10 mg/kg di peso corporeo).Come controllo sono stati utilizzati i gruppi NS e micelle bianche.La lunghezza e la larghezza del tumore sono state misurate ogni 3 giorni e il volume del tumore è stato calcolato utilizzando l'equazione Vol = 0,5 × lunghezza × larghezza2.Quando i topi di controllo sono diventati deboli, i topi sono stati sacrificati e i loro tumori sono stati rimossi per l'analisi immunoistochimica e il test di etichettatura terminale del nick (TUNEL) della deossinucleotidil transferasi dUTP.Saggi di apoptosi, proliferazione e microvasi nei tessuti tumoraliI tumori 4T1 sono stati fissati in una soluzione di paraformaldeide al 4% e quindi incorporati in paraffina.Un kit TUNEL disponibile in commercio (Promega, Madison, WI, USA) è stato utilizzato per identificare le cellule apoptotiche nei tumori.Questa analisi è stata eseguita seguendo il protocollo del produttore e i campioni sono stati quindi esaminati utilizzando un microscopio a fluorescenza (× 400).La proliferazione delle cellule tumorali è stata rilevata mediante il metodo di colorazione Ki-67.L'anticorpo primario era l'anticorpo monoclonale di ratto antitopo Ki-67 (GeneTex Inc., Irvine, CA) e l'anticorpo secondario era l'immunoglobulina di capra antitopo biotinilata (BD Biosciences).L'indice di etichettatura Ki-67 (LI) è stato calcolato come numero di cellule Ki-67 positive/numero totale di cellule contate sotto ingrandimento (× 400).I dati sono stati contati in cinque aree selezionate casualmente in ciascun campione di tumore da due ricercatori indipendenti.Per la colorazione dei vasi sanguigni, i tessuti tumorali sono stati immunocolorati con un anticorpo CD31 di capra antitopo marcatore delle cellule epiteliali (diluizione 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) e FITC anti-capra di coniglio (diluizione 1:100; Santa Cruz Biotechnology) secondario anticorpo.La densità dei microrecipienti è stata determinata come il numero medio di piccoli vasi CD31 positivi in ​​un campo ad alta potenza (× 400).L'assorbimento cellulare e il comportamento in vivo delle micelle caricate con farmaci sono stati studiati utilizzando colorante fluorescente, 1,1′-diottadecil-3,3,3′,3′- tetrametilindodicarbocianina, sale di 4-clorobenzensolfonato (DiD), come membrana cellulare fluorescente sonda.La dimensione delle particelle di DiD/M è stata determinata dall'analizzatore della dimensione delle particelle laser Malvern Nano ZS90.Il DiD/M è stato diluito con acqua pura per il rilevamento.Tutti i risultati erano la media di tre esecuzioni di test e tutti i dati sono espressi come media ± DS.Per i test sugli animali in vivo, topi BALB/c nudi femminili di 5 settimane portavano cellule di cancro al seno (1,0 × 107) nel gluteo destro.Quando il volume del tumore ha raggiunto ~ 300–400 mm3, le micelle MPEG-PCL caricate con DiD (DiD/M) o DiD libero sono state iniettate per via endovenosa attraverso la vena della coda.Dopo l'iniezione, l'imaging a fluorescenza ottica è stato eseguito posizionando ciascun topo su una piastra animale nel sistema IVI Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkington, MA, USA).Le immagini sono state ottenute 1, 4, 8 e 12 ore dopo l'iniezione dei farmaci di prova.Tutti i dati sono espressi come media ± DS.L'analisi statistica è stata eseguita mediante l'analisi della varianza unidirezionale.Differenze significative tra i gruppi sono indicate da *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.Preparazione e caratterizzazione di P–H/MIl comportamento di autoassemblaggio di P–H/M è presentato nella Figura 1A.PTX e HK sono stati distribuiti nel nucleo idrofobo PCL, mentre PEG era il segmento idrofilo al di fuori delle micelle.Dopo la purificazione, è stato caratterizzato il copolimero MPEG-PCL.Quindi, abbiamo preparato diversi tipi di campioni di micelle caricate con farmaco e valutato diversi rapporti di massa, in particolare il rapporto di massa di P–H/M, e i risultati sono mostrati nella Tabella 1. Considerando ciò, il campione S2 aveva il rapporto più appropriato per il sistema combinato P–H/M.L'EE del campione S2 era 98,2% ± 0,2% e il DL era 9,4% ± 0,3%.La dimensione delle particelle di S2 era 28,7 ± 2,5 nm con l'indice di polidispersità (PDI) di 0,06 ± 0,01 e il potenziale zeta era -1,42 ± 0,21 mV (Figura 1B e C).Nella Figura 2A, l'immagine TEM ha dimostrato che P–H/M era una forma sferica omogenea con piccole dimensioni delle particelle di circa 20 nm, il che ha rivelato che P–H/M poteva essere omodisperso e stabile in soluzione acquosa.Come mostrato nella Figura 2B, PTX e HK potrebbero essere coincapsulati in micelle polimeriche e hanno formato un sistema di micelle stabile.Figura 1 Preparazione e caratterizzazione del P–H/M.Note: (A) Schema di preparazione del P–H/M mediante autoassemblaggio del copolimero MPEG–PCL, HK e PTX;(B) dimensione delle particelle di P–H/M;e (C) potenziale zeta di P–H/M.Abbreviazioni: HK, honokiol;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PEG, poli(glicole etilenico);PTX, paclitaxel.Tabella 1 Caratterizzazione delle abbreviazioni P–H/M preparate: DL, caricamento del farmaco;EE, efficienza di incapsulamento;Hong Kong, honokiol;PDI, indice di polidispersione;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel.Figura 2 Caratterizzazione del P–H/M.Note: (A) immagine TEM del P–H/M;(B) morfologia del P–H/M (a), una polvere liofilizzata di P–H/M (b), P–H/M liofilizzato ridisperso (c), micelle bianche (d), PTX e polvere di HK in acqua (e) e acqua (f);e (C) Diffrazione dei raggi X del cristallo PTX (a), del cristallo HK (b), polvere mista di HK, PTX e MPEG-PCL (c), micelle MPEG-PCL (d) e P-H/M polvere (e).Abbreviazioni: HK, honokiol;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;TEM, microscopio elettronico a trasmissione.Il test cristallografico è stato eseguito da XRD e gli spettri sono mostrati nella Figura 2C.È stato riscontrato che i caratteristici picchi di diffrazione di PTX e HK in P–H/M sono scomparsi nello spettro XRD e c'erano solo picchi di copolimero MPEG–PCL, il che indicava che PTX e HK erano incorporati nelle micelle MPEG–PCL.I risultati nelle Figure 1 e 2 hanno suggerito che il copolimero MPEG-PCL e le micelle caricate di farmaco sono state preparate con successo.P–H/M sono stati preparati senza l'uso di tensioattivi o solventi organici tossici ed erano stabili in soluzione acquosa con piccole dimensioni delle particelle, erano quasi neutri e avevano un carico di farmaco elevato, il che indicava che P–H/M poteva essere applicato a esperimenti in vitro e somministrato per via endovenosa in vivo.Comportamento di rilascio del farmaco in vitroI profili di rilascio delle micelle caricate con il farmaco sono stati rilevati mediante HPLC.Come mostrato nella Figura 3A, ~87,3%±2,1% del PTX è stato rilasciato al supporto dal gruppo PTX libero in 48 ore, mentre solo ~32,0%±1,6% o 25,0%±2,3% è stato rilasciato dal PTX/M o Gruppo P–H/M.Come mostrato nella Figura 3B, HK libero è stato rilasciato rapidamente, l'88% in 48 ore, mentre HK è stato rilasciato solo ~ 45,3% ± 1,2% o 44,2% ± 3,1% dal gruppo HK/M o P–H/M.Dopo 2 settimane, il 62,5%±1,3% del PTX è stato rilasciato dal gruppo PTX/M e il 58,4%±2,1% del PTX è stato rilasciato dal gruppo P–H/M e il 69%±2,42% del HK è stato rilasciato dal gruppo HK/M e il 71,2%±3,1% di HK è stato rilasciato dal gruppo P–H/M.I risultati hanno indicato che il tasso di rilascio cumulativo nelle micelle caricate con il farmaco era molto inferiore a quello nel gruppo del farmaco libero.Le micelle caricate di farmaco hanno mostrato un comportamento a rilascio prolungato rispetto al farmaco libero e il comportamento di rilascio di PTX e HK non ha avuto un impatto l'uno sull'altro in P–H/M.Il comportamento di rilascio ha suggerito che un comportamento di rilascio molto più lento delle micelle caricate di farmaco potrebbe essere attribuito alla struttura core-shell delle micelle polimeriche.Figura 3 Comportamento di rilascio in vitro di PTX o HK utilizzando un metodo di dialisi modificato.Note: (A) PTX è stato rilasciato da P–H/M, PTX/M o PTX gratuito e (B) HK è stato rilasciato da P–H/M, HK/M o HK gratuito.I dati sono mostrati come media ± DS (n=3).Abbreviazioni: HK, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX;SD, deviazione standard.Il test di citotossicità di micelle bianche, PTX/M, HK/M e P–H/M contro cellule normali e cellule tumorali è stato eseguito utilizzando il metodo MTT.Come mostrato nelle Figure 4A e B, i risultati hanno suggerito che le micelle bianche avevano una bassa citotossicità sulle linee cellulari 4T1 e HEK 293 e la vitalità cellulare era ~>90% dopo 24 o 48 ore.Per verificare l'attività citotossica di P–H/M, abbiamo condotto il test MTT sulle cellule 4T1.Come mostrato nella Figura 4C, la vitalità cellulare è diminuita in ciascun gruppo con una relazione dose-dipendente con un aumento della concentrazione di micelle caricate di farmaco.Abbiamo scoperto che il valore IC50 di P–H/M era molto inferiore a quello di PTX/M o HK/M (25,0 contro 42,4 e 65,1 μg/mL), il che indicava che P–H/M migliorava la citotossicità contro le cellule 4T1.Figura 4 L'analisi della citotossicità di diversi gruppi è stata eseguita utilizzando cellule 4T1 (A) e cellule HEK 293 (B) rispettivamente per 24 e 48 ore e (C) P–H/M ha inibito la proliferazione delle cellule 4T1 per 48 ore.Note: I dati sono mostrati come media ± DS (n=6).4T1, linea cellulare di carcinoma mammario murino.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.Abbreviazioni: HEK 293, rene embrionale umano 293;Hong Kong, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX;SD, deviazione standard.Negli studi di citotossicità, abbiamo scoperto che le micelle bianche avevano una bassa citotossicità e una buona biocompatibilità.Il P–H/M ha mostrato una maggiore tossicità rispetto a PTX/M e HK/M contro le linee cellulari 4T1.Tutti i risultati hanno rivelato che PTX e HK coincapsulati potrebbero migliorare la citotossicità dei farmaci contro le cellule del cancro al seno.Analisi dell'assorbimento cellulare in vitroAl fine di studiare il progresso del miglioramento dell'effetto citotossico di P-H/M sulle cellule 4T1, abbiamo utilizzato un metodo quantitativo per studiare la quantità crescente di assorbimento cellulare di PTX e HK.Come mostrato nella Figura 5A, PTX si è accumulato in modo simile nel gruppo PTX/M o P–H/M nelle cellule 4T1 dopo l'incubazione per 2 o 4 ore.Allo stesso modo, HK è stato ripreso in modo analogo in entrambi i gruppi P-H/M e HK/M dopo 2 o 4 ore di incubazione nelle cellule 4T1 (Figura 5B).I risultati hanno indicato che sia HK che PTX potrebbero accumularsi nelle cellule tumorali e che ciascuno non ha influenzato l'assorbimento dell'altro, aumentando la citotossicità del sistema di somministrazione del doppio farmaco P–H/M.Figura 5 Assorbimento cellulare di diversi gruppi in cellule 4T1 in vitro.Note: (A) la quantità di PTX nelle cellule 4T1 per 2 o 4 ore e (B) la concentrazione di HK nelle cellule 4T1 per 2 o 4 ore.I dati sono mostrati come media ± DS (n=3).4T1, linea cellulare di carcinoma mammario murino.*P<0,05.Abbreviazioni: HK, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX;SD, deviazione standard.Saggio di apoptosi delle cellule 4T1L'induzione dell'apoptosi di P–H/M contro le cellule 4T1 è stata analizzata mediante saggio FCM.Come mostrato nella Figura 6, la percentuale di cellule apoptotiche era 34,02%±0,05% nel gruppo P–H/M, che era superiore a quella nel gruppo PTX/M (26,37%±0,08%) e HK/M ( gruppo 20,15%±0,11%).Ciò indicava che P–H/M aumentava l'apoptosi delle cellule tumorali 4T1 in modo più efficace rispetto ad altri gruppi in vitro (P <0,05).I risultati hanno indicato che P–H/M potrebbe indurre più apoptosi rispetto ai gruppi di controllo.Figura 6 Apoptosi delle cellule 4T1 indotta da diversi gruppi.Note: (A–E) NS, micelle bianche, gruppo PTX/M, HK/M e P–H/M, rispettivamente, e (F) la percentuale di annessina V+/PI-, annessina V-/PI+ e apoptosi totale in diversi gruppi.I risultati rappresentano tre esperimenti indipendenti.I dati sono mostrati come media ± DS (n=3).***P<0,001.4T1, linea cellulare di carcinoma mammario murino.Abbreviazioni: FITC, isotiocianato di fluoresceina;Hong Kong, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);NS, soluzione fisiologica normale;Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PI, ioduro di propidio;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX;SD, deviazione standard.Abbiamo usato Western blot per rilevare l'espressione delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi nelle linee cellulari 4T1.Secondo la Figura 7, le proteine ​​della famiglia delle caspasi (caspasi 3 tagliata, caspasi 8 tagliata e caspasi 9 tagliata) erano sovraregolate maggiormente nei gruppi di micelle rispetto al gruppo NS e al gruppo di micelle vuote.Inoltre, l'attivazione della proteina dell'apoptosi della caspasi scissa era molto maggiore nel gruppo P-H/M rispetto ai gruppi PTX/M e HK/M.Il gruppo NS e il gruppo delle micelle bianche sono stati usati come controlli.Il Western blot ha indicato che P–H/M ha aumentato maggiormente l'attivazione della caspasi 3 (35 kDa), della caspasi 8 (57 kDa) e della caspasi 9 (45 kDa) rispetto alla caspasi 3 scissa (17 e 19 kDa), della caspasi 8 scissa ( 10 kDa) e la caspasi 9 (35 kDa) scissa rispetto ad altri.Figura 7 Gli effetti di induzione di P–H/M sulle proteine ​​associate all'apoptosi.Note: La caspasi 3, la caspasi 3, la caspasi 8, la caspasi 8 e la caspasi 9, la caspasi 9, espresse in cellule 4T1 trattate con NS, micelle bianche, HK/M, PTX/M o P–H/M.L'analisi Western blot ha mostrato che P–H/M induceva una maggiore espressione delle proteine ​​dell'apoptosi.4T1, linea cellulare di carcinoma mammario murino.Abbreviazioni: HK, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);NS, soluzione fisiologica normale;Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX.Attività antitumorale di P–H/M in vivoAbbiamo usato topi Balb/c portatori di carcinoma mammario sottocutaneo 4T1 per confrontare l'effetto antitumorale di P–H/M in vivo con PTX/M, HK/M, micelle bianche e gruppi NS.Come mostrato nella Figura 8, abbiamo scoperto che P-H/M (557,64 ± 243,81 mm3) era più efficiente nell'inibire la crescita del tumore rispetto a PTX/M (932,70 ± 256,43 mm3) e HK/M (1.463,77 ± 148,74 mm3).Le micelle bianche (2.178,35 ± 247,41 mm3) non hanno avuto alcun effetto antitumorale rispetto al gruppo NS (2.207,62 ± 214,17 mm3).Nel frattempo, il peso del tumore di P–H/M era inferiore a quello dei gruppi PTX/M e HK/M, mentre le micelle bianche erano simili al gruppo NS.Le misurazioni del peso corporeo (Figura 8) non hanno mostrato differenze significative tra i gruppi durante lo studio.Tutti i risultati nella Figura 8 hanno suggerito che P–H/M erano più efficienti nel sopprimere la crescita del tumore rispetto a PTX/M e HK/M.La figura 8 P–H/M ha inibito la crescita del tumore nel modello 4T1 sottocutaneo.Note: (A) fotografie rappresentative di tumori sottocutanei in ciascun gruppo;(B) soppressione della crescita del tumore sottocutaneo da parte di ciascun gruppo nei topi;(C) peso dei tumori sottocutanei in ciascun gruppo;e (D) peso corporeo in ciascun gruppo.I dati sono mostrati come media ± DS.***P<0,001.4T1, linea cellulare di carcinoma mammario murino.Abbreviazioni: HK, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);NS, soluzione fisiologica normale;Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX;SD, deviazione standard.La colorazione con ematossilina-eosina (H&E) è stata eseguita per l'analisi istologica sui tessuti tumorali (Figura 9).Rispetto ai gruppi PTX/M e HK/M, il gruppo P–H/M ha mostrato più aree di necrosi.Questi risultati hanno indicato che la P-H/M ha soppresso la proliferazione delle cellule tumorali e ha migliorato l'efficacia antitumorale.Inoltre, i risultati non hanno mostrato alterazioni patologiche nei polmoni, nel cuore, nei reni, nella milza o nel fegato, il che ha dimostrato che il polimero MPEG-PCL aveva bassi effetti collaterali e una buona biocompatibilità sui tessuti normali.Figura 9 Colorazione H&E di tumori in diversi gruppi.Note: colorazione H&E di NS (A);micelle bianche (B);HK/M (C);PTX/M (D);e gruppi P–H/M (E).Abbreviazioni: H&E, colorazione ematossilina-eosina;Hong Kong, honokiol;HK/M, micelle caricate con HK;MPEG–PCL, metossipoli(glicole etilenico)–poli(caprolattone);NS, soluzione fisiologica normale;Micelle MPEG–PCL combinate P–H/M, PTX e HK;PTX, paclitaxel;PTX/M, micelle caricate con PTX.La densità dei vasi dei tessuti tumorali è stata testata mediante colorazione immunoistochimica CD31 su diversi gruppi nel modello di cancro al seno 4T1.***P<0,001.***P<0,001.***P<0,001.Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.Biomateriali.Int J Pharm.Droghe.JClin Oncol.Eur J Pharmacol.Eur J Pharmacol.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.Eur J Pharmacol.Sangue.Nanoscala.J Biomed Nanotecnologia.Nanoscala.J Rilascio del controllo.Cancro.Nanoscala.Colloidi Surf B Biointerfacce.Biomateriali.Biomateriali.Mol Farm.Interfacce ACS Appl Mater.Fr. J Pharmacol.Int J Clin Exp Med.Obiettivo.Curr Med Chem.J Rilascio del controllo.2000;65(1–2):271–284.Questo lavoro è pubblicato e concesso in licenza da Dove Medical Press Limited.I termini completi di questa licenza sono disponibili su https://www.dovepress.com/terms.php e incorporano la licenza Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0).Accedendo all'opera accetti i Termini.Gli usi non commerciali dell'opera sono consentiti senza ulteriore autorizzazione da parte di Dove Medical Press Limited, a condizione che l'opera sia adeguatamente attribuita.Per l'autorizzazione all'uso commerciale di quest'opera, consultare i paragrafi 4.2 e 5 dei nostri Termini.Contattaci • Informativa sulla privacy • Associazioni e partner • Testimonianze • Termini e condizioni • Segnala questo sito • TopContattaci • Informativa sulla privacy© Copyright 2022 • Dove Press Ltd • sviluppo software di maffey.com • Web Design di AdhesionLe opinioni espresse in tutti gli articoli qui pubblicati sono quelle degli autori specifici e non riflettono necessariamente le opinioni di Dove Medical Press Ltd o dei suoi dipendenti.Dove Medical Press fa parte di Taylor & Francis Group, la divisione Academic Publishing di Informa PLC Copyright 2017 Informa PLC.Tutti i diritti riservati.Questo sito è di proprietà e gestito da Informa PLC ("Informa") la cui sede legale è 5 Howick Place, London SW1P 1WG.Registrato in Inghilterra e Galles.Numero 3099067. 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